molezz BAR 世界尽头 » PCR http://www.molezz.net a man can be destroyed but not defeated -- 生物技术和计算机技术 Sun, 18 Sep 2011 05:48:49 +0000 en hourly 1 http://wordpress.org/?v=3.1.3 Real-Time(RT)定量PCR仪器rotor-gene操作使用教程 http://www.molezz.net/drink/real-time-rotor-gene-tutorial/ http://www.molezz.net/drink/real-time-rotor-gene-tutorial/#comments Wed, 20 May 2009 03:06:36 +0000 molezz http://www.molezz.net/archives/206 去年做过一次Real-Time PCR(RT-PCR),最近又要做,却突然发现已经忘了怎么操作rotor-gene这个软件了,看来有时记录还是很重要的,尤其是做的次数少的实验,所以整理下操作步骤.下次简单记录下后期数据的分析处理.由于操作的是rotor-gene和SYBR Green I,所以底下以此为做法操作.

1.运行软件,选择SYBR Green(R) I (如果使用taqman探针,则选择dual labeled probe程序)
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2.根据管子选择平头还是凸头管
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3.选择fam/sybr,edit profile,hold处选择时间和温度,如94度8分钟
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4.cycling处设置变性,退火,延伸温度和时间,可以直接用鼠标拉动边缘调节(如果使用taqman探针则用两步法,94度15秒,60度1min).循环数45-50
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5.点击start run,选择保存位置,开始运行
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6.可以看运行所需时间,xx minutes remaining,时间到自动结束,打开保存文件分析即可
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]]> http://www.molezz.net/drink/real-time-rotor-gene-tutorial/feed/ 0 学会了real time PCR的基本方法 http://www.molezz.net/drink/real-time-pcr-method/ http://www.molezz.net/drink/real-time-pcr-method/#comments Sat, 30 Aug 2008 23:50:00 +0000 molezz http://bar.molezz.org/?p=11 small[1].jpg前2周由于老板提出对RT PCR(Reverse transcriptase-PCR)的质疑,因此要求进行real time PCR验证,我想正好学习一下新东西.以前看GMO组的real time花花绿绿的曲线,完全没有头绪,经过这次实战,总算基本了解了其中的一些含义,虽然还有很多不明白.实验主要使用SYBR Green I测量,这个是real time PCR最基础使用的试剂.

第一次做的时候,居然模板只加了1ul,虽然最后的结果不弥散,不过还是不应该,模板量高才能减少误差,RT基本原理.后来进行的一次,增加了模板的量, 不过有2个样效果偏差比较大,据说机器最近有些孔有问题,打算等自己实验室的机器修好了再做一次,顺便把expression pattern也做一次看看.最近和张博讨论到我的结果,指出缺少actin对照….看来我还要接着再做几个,他指出最后老板肯定是要一个柱状图,这我倒是不会做,到时再请教了.

还是学些新东西比较对我的脾气,我喜欢多学点东西,而不是每天做着同一样重复步骤,虽然操作熟练是必要的,但是我读博士可不是为了狭窄的那一点点实验技术.增加更多的见识,今后出来才能多多变通.

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